抗人大腸桿菌免疫雞蛋黃抗體的研究

    高免蛋黃抗體具有生產(chǎn)過程簡單、效率高等特點，已越來越多地應(yīng)用于人類許多疾病的預(yù)防和治療以及生物學(xué)的高度特異性檢測等領(lǐng)域中，并取得顯著成效。本文主要研究了以人致病性大腸桿菌為抗原，免疫母雞，研究獲得含有價蛋黃抗體的雞蛋的*條件；建立快速、準確、定量的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定蛋黃抗體（IgY）效價的技術(shù)；研究抗人大腸桿菌IgY分離純化條件及其理化、生化特性；研究食品加工過程中的各種因素對大腸桿菌特異IgY生物活性的影響；探討抗人大腸桿菌免疫雞蛋抗體的功能及其機理；評估蛋黃抗體的安全性。

    主要獲得如下結(jié)果：

（1） 對獲得含有價蛋黃抗體的雞蛋的*條件研究發(fā)現(xiàn)： （a） 以大腸桿菌懸浮液對20周齡京白蛋雞免疫時，若固定免疫抗原劑量為0.5ml，則當菌液濃度低于1×10~9 cfu／ml，免疫應(yīng)答強度隨免疫劑量的降低而降低，當菌液濃度高于1×10~9 cfu／ml時，免疫應(yīng)答強度不會隨免疫劑量的增加而得到明顯加強。因此，確定*免疫劑量為每次0.5ml菌液濃度為1×10~9 cfu／ml的大腸桿菌懸浮液。 （b） 在大腸桿菌懸液中添加等量的福氏*佐劑、福氏不*佐劑和白油佐劑能明顯加強免疫應(yīng)答強度，其中福氏*佐劑對免疫應(yīng)答加強的程度zui高。 （c） 胸部皮下注射、翅下皮下注射、大腿皮下注射、頸背皮下注射、胸部肌肉注射、翅下肌肉注射、大腿肌肉注射和頸背肌肉注射8種不同免疫途徑對免疫應(yīng)答反應(yīng)強度沒有明顯影響。 （d） 強化免疫程序能大大加強產(chǎn)蛋母雞的免疫應(yīng)答強度，其中初免后，每隔1周強化免疫一次，連續(xù)4次，此后每1月僅用佐劑抗原強化免疫1次的強化免疫程序既經(jīng)濟又有效。

（2） 采取熱酚法提取E.coli LPS作為抗原，以酶標記的兔抗雞IgY抗抗體（IgG）為二抗建立起來的間接ELISA技術(shù)檢測特異蛋黃抗體IgY的抗體效價，以酶標二抗工作濃度為1：2000，LPS抗原包被濃度為1：20（10ug／ml），可以檢測到雞特異IgY抗體效價為1：10240。用豬源EHEC和人源沙門氏菌的LPS抗原進行了交叉檢測，表現(xiàn)出高度的特異性。

（3） 通過對蛋黃抗體（IgY）的分離純化條件研究發(fā)現(xiàn)，乙醇沉淀抗體的*條件是粗提液：乙醇（V／V）為1：0.35；經(jīng)DEAE-Sephrose fast-flow離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠排阻層析連續(xù)純化后可得到電泳純的抗人大腸桿菌IgY，其MW為186400Da（電泳法）或186500Da（凝膠過濾法），該抗體由兩個亞基構(gòu)成，分子質(zhì)量分別為65900Da和24600Da，其等電點為5.5。

（4） 通過穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)： （a） 抗人大腸桿菌IgY抗體在高溫下（≥75℃）容易發(fā)生熱變性，其熱變性的反應(yīng)級數(shù)為1.5，其熱變性溫度點為75.0℃。 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)博l:學(xué)位論文 （b）抗人大腸桿菌抗體在酸性環(huán)境容易發(fā)生變性，而在中性和弱堿性環(huán)境中能較好的保 持穩(wěn)定，其主要變性發(fā)生在pH2.5一3.0。 （c）胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對抗人大腸桿菌抗體的活性保持均有不利的作 用，但發(fā)現(xiàn)，經(jīng)上述3種消化道蛋白質(zhì)水解酶部分作用后形成的抗體水解物仍具有一定的抗 體活性。進一步研究確定，在灌胃后lh內(nèi)，小腸內(nèi)抗體活性基本保持在zui高水平，而在Zh 之后，抗體活性大幅度下降，在灌胃后16h已經(jīng)下降到了非常低的水平。 （d）將抗人大腸桿菌抗體貯存在O℃和4℃是比較合適的，若貯存在25℃以上的溫度下， 抗體活性損失隨貯存期的延長而不斷下降。 （e）加熱處理、蛋白酶處理以及冷凍干燥處理對抗體的活性都有不利的影響，但一定濃 度的乳糖、環(huán)糊精和糊精能加強抗體對熱處理和蛋白酶處理的穩(wěn)定性，而環(huán)糊精、乳糖、糊 精、果糖、葡萄糖、甘氨酸和甘油都能不同程度的加強抗體在冷凍干燥過程中的穩(wěn)定性。

（5）通過對抗人大腸桿菌免疫蛋黃抗體的功能及其機理探討發(fā)現(xiàn)，抗人人腸桿菌卵黃抗體 濃度大于sm留ml，可對大腸桿菌有明顯的體外抑菌作用;抗人大腸桿菌IgY對大腸桿菌誘導(dǎo) 的乳鼠腸道感染具有顯著的預(yù)防和治療作用;抗人大腸桿菌卵黃抗體可抑制大腸桿菌對腸上 皮細胞粘附作用，隨著大腸桿菌濃度的不斷升高，粘附率不斷增加，上皮細胞濃度的增加能 提高ETEC對其的粘附率。

（6）研究發(fā)現(xiàn)，4.0 kGy的“。c。丫射線可使蛋中可能污染的微生物全部滅活，而不影響 抗體活性;雞抗人大腸桿菌抗體對臨床檢查、血液學(xué)、生化學(xué)、器官重量、系數(shù)及組織病理 學(xué)等指標無明顯影響，證明雞蛋黃抗體IgY無急、‘漫性毒副作用:通過骨髓嗜染紅細胞微核 試驗、小鼠精子畸形試驗及Ames試驗，結(jié)果證明雞抗人大腸桿菌抗體無細胞毒，無致突變作用。