酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法( Enzyme- Linked lmmunosorbentAssay; 簡(jiǎn)稱ELISA) 是從酶標(biāo)記抗體技術(shù)發(fā)展起來的。1966 年, Nakane 和Avrameas 首先用酶標(biāo)記抗體在普通光學(xué)顯微鏡下定位抗原。1971 年, Engvall 和Perlman 以及Weeman 和Schuurs仿照放射免疫測(cè)定法( RIA) 的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定原理, 使酶標(biāo)抗原與待測(cè)標(biāo)本中的未標(biāo)記的抗原, 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一定量的抗體, 然后分離游離的和結(jié)合的標(biāo)記抗原, 測(cè)定酶活性, 即可得到待測(cè)抗原量。次年, Engvall等改用酶標(biāo)記免疫球蛋白, 提高了標(biāo)記效率,避免了半抗原標(biāo)記困難的問題, 也簡(jiǎn)化了操作手續(xù)[ 1] 。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法結(jié)合了免疫熒光法和放射免疫測(cè)定法兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn), 具有可定量、反應(yīng)靈敏準(zhǔn)確、標(biāo)記物穩(wěn)定、適用范圍寬、檢測(cè)速度快以及費(fèi)用低等特點(diǎn)
1 ?? 酶聯(lián)免疫吸附的原理與方法
1. 1 ?? 原理
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的基本原理是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預(yù)先結(jié)合到某種固相載體表面; 測(cè)定時(shí), 將受檢樣品( 含待測(cè)抗體或抗原) 和酶標(biāo)抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)形成抗原或抗體復(fù)合物; 反應(yīng)終止時(shí), 固相載體上酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合量( 免疫復(fù)合物) 即與標(biāo)本中待檢抗體或抗原的量成一定比例; 經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其他物質(zhì), 加入酶反應(yīng)底物后, 底物即被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物, zui后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)含量[ 2] 。
1. 2 ?? 方法
ELISA 常用的測(cè)定方法主要有直接法和間接法兩種: 直接法是酶標(biāo)記抗體與待檢測(cè)樣本中固相抗原直接作用, 加入底物后, 顯色( 其顏色深淺與樣本中抗原量成正比) ; 間接法是使已知抗原吸附在固相載體上, 與待檢測(cè)樣本中的抗體作用, 再加入酶標(biāo)記抗同種動(dòng)物抗體的免疫球蛋白( 抗抗體) , 使與特異抗原抗體復(fù)合物中的抗體作用, 加入酶底物, 顯色( 顏色深淺與樣本中抗體量成正比) [ 1] 。ELISA 有許多改良方法, 如雙抗體法( sandwichELISA) 、雙抗體夾心法( double_antibody sandwichtechnique) 、競(jìng)爭(zhēng)法、酶- 抗酶法和均質(zhì)法( homogeneousELISA) 、生物素- 親和素放大系統(tǒng)( biotina-vidin system, BAS) ELISA 及斑點(diǎn)_ELISA ( dot_ELISA)等, 大致可分為三類: ( a) 測(cè)定抗體的間接法; ( b)測(cè)定抗原的雙抗體夾心法: ( c) 測(cè)定抗原的競(jìng)爭(zhēng)法[ 3] 。前兩種方法主要用于測(cè)定抗體和大分子抗原, 適用于臨床診斷上, 而競(jìng)爭(zhēng)法是測(cè)定小分子抗原的方法, 因而尤其適用于食品分析。競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法又可分為直接競(jìng)爭(zhēng)法和間接競(jìng)爭(zhēng)法。直接競(jìng)爭(zhēng)法主要有三步: 抗體吸附于固相載體, 溫育后清洗?? 加入含有抗原的待測(cè)液及酶標(biāo)記的抗原, 溫育后清洗?? 加入酶底物溫育后顯色, 判斷結(jié)果。間接競(jìng)爭(zhēng)法主要有四步: 抗原吸附于固體載體, 溫育后清洗??加入含有抗原的待測(cè)液和抗體, 溫育后清洗?? 加入酶標(biāo)記抗體, 溫育后清洗?? 加入酶底物溫育后顯色, 判斷結(jié)果[ 4] 。
1. 3 ?? 操作要點(diǎn)
影響ELISA 測(cè)定結(jié)果的因素主要包括以下幾點(diǎn):
( 1) 抗原包被的質(zhì)量。將抗原固定于聚苯乙烯微量反應(yīng)板中稱之為包被, 其效果好壞是影響抗原?? 抗體反應(yīng)的重要因素;
( 2) 非特異性反應(yīng)干擾的排除。除了設(shè)置稀釋液空白、陽(yáng)性和陰性參比血清等對(duì)照外, 可采用包埋、封閉等預(yù)處理, 如在包被液中加入牛血清白蛋白、明膠或吐溫- 20 等, 以減少非特異性反應(yīng)的發(fā)生。高選擇性的單克隆抗體代替多克隆抗體也是提高ELISA 特異性的另一有效途徑[ 3] 。此外, 選擇表面積較大的固相載體, 也有利于提高ELISA 的敏感性;(3) 酶和交聯(lián)劑的選擇。用于ELISA 標(biāo)記的酶, 主要有辣根過氧化氫酶(HRP) 、堿性磷酸酯酶(AKP) 、葡萄糖氧化酶( GO) 和半乳糖苷酶等, 而以HRP 用得較多。酶和抗體交聯(lián)可用免疫法( 酶-抗酶抗體) 或化學(xué)法, 常用化學(xué)法。一般來說, HRP與抗體的交聯(lián)現(xiàn)多采用改良Wilson?? s 法( 高碘酸鈉
氧化法) , AKP 與抗體交聯(lián)通常有戊二醛法和偶氮法[ 3] ;( 4) 酶底物。它本身要求無(wú)色, 反應(yīng)后能穩(wěn)定呈色。一般HRP 常采用鄰苯二胺( 產(chǎn)物桔黃色, 可穩(wěn)定呈色數(shù)小時(shí)) 或鄰聯(lián)甲苯胺作酶底物; AKP 常用對(duì)硝基苯磷酸鹽作酶底物。
2?? 酶聯(lián)免疫吸附在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用
2. 1 ?? 細(xì)菌的檢測(cè)
檢測(cè)方法( 薄層層析法TLC、放射免疫分析法RIA、液相色譜法HPLC)進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 及間接競(jìng)爭(zhēng)LISA 具有靈敏、特異、簡(jiǎn)便、快速、安全、價(jià)廉等特點(diǎn), 適合在我國(guó)基層推廣應(yīng)用。路戈等[ 14] ( 1996 年) 利用抗AFB1 的單克隆抗體建立了檢測(cè)食品( 玉米、花生、小麥、大米、植物油) 中AFB1 的ELISA 間接競(jìng)爭(zhēng)法。該方法zui低檢出濃度為0. 0lng/ g, 敏感范圍為0. 2~ 50ng/ g, 平均回收率為83. 0~ 110. 3%, 精密度為2. 0~ 24. 3%。用該法測(cè)定了分布于淮河以北地區(qū)的1455 份樣品, 并對(duì)25 份植物油樣品用TIC 和ELISA 兩種方法進(jìn)行了對(duì)比測(cè)定。結(jié)果表明, 在方法靈敏度下( 5ng/ g ) TLC 均無(wú)AFB1 檢出, 而ELISA 法AFB1 檢出率為96%, ELISA法的檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于TLC 法。黃薇等[ 15]( 2002年) 運(yùn)用ELISA 并使用試劑盒對(duì)292 份樣品進(jìn)行了黃曲霉素B1 的檢驗(yàn), 并與薄層法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明: 回收率為72% ~ 95% , 變異系數(shù)為2. 76% , 與薄層法相比, 該法快速、簡(jiǎn)便、靈敏、安全。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)食品中赭曲霉毒素A的方法, 也有綜述性介紹[ 16] 。
2. 3 ?? 食品介導(dǎo)的病毒的檢測(cè)
ELISA 方法一直被用于食品從業(yè)人員的甲肝、乙肝病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查[ 1. 17- 20] 。黃漢菊, 黃振武等[ 21]( 2001 年) 采用間接酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)四川省克山病病區(qū)30 例潛、慢型克山病患者血清中CoxBl ?? 6 ?? IgM 和CoxBl ?? 6 ?? IgG進(jìn)行檢測(cè), 了解柯薩奇B 組病毒( CoxB) 感染與克山病的相關(guān)關(guān)系。表明病區(qū)潛、慢型克山病患者有CoxB 感染存在。應(yīng)用ELISA 方法, 可將無(wú)明顯臨床癥狀的海綿狀病毒( BSE) 感染動(dòng)物可被檢出, 經(jīng)對(duì)朊蛋白Westem 印跡法檢測(cè)牛及羊朊病毒蛋白的分析, 證明該方法是有效的。我國(guó)已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、合流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用, 建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù), 已形成試劑盒生產(chǎn)能力[ 6] 。ELISA 法除了在上述食品微生物檢測(cè)中發(fā)揮重要作用外, 已有用于有益微生物的檢測(cè)的報(bào)道,如采用間接ELISA 法進(jìn)行雙歧桿菌制劑產(chǎn)品的品質(zhì)監(jiān)測(cè)[ 7] 。
2. 2 ?? 真菌毒素的檢測(cè)
劉濱磊等[ 13]( 1990 年) 繼李秀芳等( 1987 年) 建立反向直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法測(cè)定黃曲霉毒素B1(AFBl) 之后, 又建立了直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 及生物素?? 親合素ELISA( BA- ELISA) 三種檢測(cè)食品中黃曲霉毒素B1 的方法。并將此四種方法進(jìn)行了比較。另外, 將ELISA 方法與其它AFB1檢測(cè)方法( 薄層層析法TLC、放射免疫分析法RIA、液相色譜法HPLC)進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 及間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 具有靈敏、特異、簡(jiǎn)便、快速、安全、價(jià)廉等特點(diǎn), 適合在我國(guó)基層推廣應(yīng)用。路戈等[ 14] ( 1996 年) 利用抗AFB1 的單克隆抗體建立了檢測(cè)食品( 玉米、花生、小麥、大米、植物油) 中AFB1 的ELISA 間接競(jìng)爭(zhēng)法。該方法zui低檢出濃度為0. 0lng/ g, 敏感范圍為0. 2~ 50ng/ g, 平均回收率為83. 0~ 110. 3%, 精密度為2. 0~ 24. 3%。用該法測(cè)定了分布于淮河以北地區(qū)的1455 份樣品, 并對(duì)25 份植物油樣品用TIC 和ELISA 兩種方法進(jìn)行了對(duì)比測(cè)定。結(jié)果表明, 在方法靈敏度下( 5ng/ g ) TLC 均無(wú)AFB1 檢出, 而ELISA 法AFB1 檢出率為96%, ELISA法的檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于TLC 法。黃薇等[ 15]( 2002年) 運(yùn)用ELISA 并使用試劑盒對(duì)292 份樣品進(jìn)行了黃曲霉素B1 的檢驗(yàn), 并與薄層法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明: 回收率為72% ~ 95% , 變異系數(shù)為2. 76% , 與薄層法相比, 該法快速、簡(jiǎn)便、靈敏、安全。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)食品中赭曲霉毒素A的方法, 也有綜述性介紹[ 16] 。
2. 3 ?? 食品介導(dǎo)的病毒的檢測(cè)
ELISA 方法一直被用于食品從業(yè)人員的甲肝、乙肝病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查[ 1. 17- 20] 。黃漢菊, 黃振武等[ 21]( 2001 年) 采用間接酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)四川省克山病病區(qū)30 例潛、慢型克山病患者血清中CoxBl ?? 6 ?? IgM 和CoxBl ?? 6 ?? IgG進(jìn)行檢測(cè), 了解柯薩奇B 組病毒( CoxB) 感染與克山病的相關(guān)關(guān)系。表明病區(qū)潛、慢型克山病患者有CoxB 感染存在。應(yīng)用ELISA 方法, 可將無(wú)明顯臨床癥狀的海綿狀病毒( BSE) 感染動(dòng)物可被檢出, 經(jīng)對(duì)朊蛋白Westem 印跡法檢測(cè)牛及羊朊病毒蛋白的分析, 證明該方法是有效的。我國(guó)已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、合流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用, 建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù), 已形成試劑盒生產(chǎn)能力[ 6] 。ELISA 法除了在上述食品微生物檢測(cè)中發(fā)揮重要作用外, 已有用于有益微生物的檢測(cè)的報(bào)道,如采用間接ELISA 法進(jìn)行雙歧桿菌制劑產(chǎn)品的品質(zhì)監(jiān)測(cè)[ 7]

3 ?? 結(jié)語(yǔ)
自從上世紀(jì)60、70 年代ELISA 技術(shù)建立以來,無(wú)論是該方法本身的改進(jìn)方面, 還是其應(yīng)用領(lǐng)域的拓展方面都有了很大的進(jìn)步, 包括試劑的靈敏性、穩(wěn)定性和通用性的增強(qiáng), 自動(dòng)檢測(cè)儀器的開發(fā), 以簡(jiǎn)捷、靈敏和微量化的情況下, ELISA 技術(shù)較之其它方法顯示了很大的優(yōu)勢(shì)。但同時(shí)它也不可避免地存在著一些缺陷, 如存在交叉反應(yīng), 對(duì)試劑的選擇性高, 難于同時(shí)分析多種成分等。隨著有關(guān)研究和探索的不斷深入, 可以相信ELISA 技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中將會(huì)發(fā)揮更為重要的作用。