微生物營養和環境條件實驗

實驗用品

接種環、酒精燈、9 mL無菌水、1 mL無菌吸管、無菌水、無菌平皿、玻璃刮鏟、滅菌五角星形圖案紙（牛皮紙或黑紙）、紫外燈箱、無菌鑷子、直徑0.6cm的無菌圓形濾紙片；或其它實驗用品。

實驗設計方案的基本要求

本實驗是在已經做了微生物的一些基本實驗和綜合實驗的基礎上進行的，實驗設計方案中應簡明地闡述實驗目的、原理、材料、實驗方法、觀測結果以及結果分析等內容。

（一）擬訂實驗目的

實驗目的應該寫明：通過何種設計方案，采用哪種方法，說明哪些因素對微生物生長有影響，影響程度如何；從本次實驗本人可以獲得哪些收獲等等。

（二）確定實驗原理

對 自己的實驗設計方案、方法從理論上說明依據。如微生物生長需要哪些營養物質，包括有機物、礦質營養元素；微生物與氧氣的關系；微生物的生長溫度范圍；微生 物生長繁殖需要的酸堿度即pH值環境；紫外線對微生物的作用；化學藥劑對微生物的生長抑制或殺死作用等等，應根據試驗目的靈活選擇。

（三）確定實驗材料

實驗材料應根據自己的實驗目的來確定，可以是實驗室已有的活菌種，也可以是自己從環境中分離得到的微生物材料。

（四）設計實驗方法

實驗方法的確定也應該根據實驗目的進行。應該包括菌種的選擇、配制何種培養基、需要哪些器材和藥品、怎樣接種、怎樣培養、怎樣觀察結果等等。可供參考的實驗方法如下：

1、營養元素對黑曲霉生長的影響

⑴制備培養基：本實驗分組配制培養基，培養基配方見附錄1-8。培養基分裝試管，每管裝量4～5mL，0.1MPa滅菌30min后備用。

⑵孢子懸液制備：取無菌水1支，用接種環從黑曲霉斜面菌種管中挑取菌體2～3環，放入水中，充分混勻，備用。

⑶接種：每人取*、缺C、缺N、缺P、缺K和缺Zn培養液各一支，用1 mL無菌吸管按無菌操作法接種黑曲霉孢子懸液0.5 mL。本實驗按每4人取一套培養基不接種作為對照。

⑷觀察：接種后，將培養管置28℃溫度下培養5～7d ,觀察黑曲霉菌絲及孢子生長情況。★該試驗用細菌類微生物作試驗菌種能觀察到明顯的結果嗎？為什么？

2、氧氣對微生物生長的影響

⑴菌懸液制備：用接種環按無菌操作法取根瘤菌、巴斯德梭菌、大腸桿菌1～2環分別放入三支無菌水中制成菌懸液。

⑵接種：取已熔化并保溫在50℃左右的培養基6支，用無菌吸管分別及取菌懸液0.2 mL接種到培養管中，每種試驗菌接種2個重復，接種后立即置振蕩器上混勻，并冷凝。

⑶培養：置培養管于28～30℃下培養3d。

⑷結果檢查：取出培養管，觀察并記錄每支培養管的上、中、下各層次中細菌的菌苔大小，菌體集中分布的位置，以了解氧氣對幾種細菌生長的影響。

3、溫度對微生物生長的影響

⑴接種：取牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養基8支，用接種環按無菌操作法分別在斜面上劃線接種大腸桿菌與枯草桿菌，勿劃破培養基。

⑵培養：將已接種的斜面培養基，分別放在4℃、28℃、37℃和45℃四種溫度下培養。

⑶觀察：培養48h、72h后觀察生長狀況，根據菌苔的大小確定其生長zui適溫度。

4、氫離子濃度對微生物生長的影響

⑴培養基制備：分組按下列配方配制不同pH值的培養基，并用pH計校證pH值，然后分裝入試管中，每管裝量5～6 mL,0.1Mpa滅菌30min備用，見表。

⑵接種培養：取供試pH培養基三組用接種環按無菌操作法于試管中分別接入大腸桿菌、吸水鏈霉菌、黑曲霉。在37℃下培養48h。

⑶檢查結果：出取培養物，觀察并記錄實驗結果。

5、紫外線殺菌試驗

⑴制平板：取無菌平皿6套，將已熔化并冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基

不同pH值培養基配制表

按無菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。

⑵菌懸液制備：取試管無菌水2支，以無菌操作法分別取金黃色葡萄球菌和黏質沙雷氏菌各2環，接入無菌水中充分搖勻，制成菌懸液。

⑶接種：將已倒入培養基的平皿分成2組，每組3個，一組接金黃色葡萄球菌，一組接沙雷氏菌，用無菌吸管吸取已制好的菌懸液各0.1 mL，分別在接種于二組平板上，用無菌玻璃刮鏟布均涂勻，隨即用無菌鑷子夾取無菌圖案紙一張，小心放在接種好的平皿中央。

⑷分組：將接種的六個平皿分為三組，每組一個金黃色葡萄球菌，一個黏質沙雷氏菌。

⑸紫外線處理：將紫外燈先開燈預熱2～3min。再將上述平皿置于紫外燈下，打開皿蓋，在30cm距離處照射。一組照1min，1組照5min，1組照10min，小心地取下圖案紙，蓋上皿蓋。用黑布或厚紙遮蓋，送入培養室內。★此時能否不進行遮蓋處理，直接拿出來培養？

⑹培養：將平皿于28～30℃溫度下培養48h。

⑺觀察：兩菌在不同的處理條件下的生長狀況，即有無生長、生長數量多少、生長的位置等。

6、化學藥劑對微生物的作用

⑴制平板：取無菌平皿3套，將已熔化并冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基按無菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。

⑵制備菌懸液：取無菌水3支，用接種環分別取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌各1～2環接入無菌水中，充分混勻，制成菌懸液。

⑶接種：用無菌吸管分別吸取已制好的菌懸液0.1mL接種于平板上，用無菌玻璃刮鏟涂勻。注意做好標記。

⑷浸藥：將滅菌濾紙片浸入供試藥劑中。

⑸加藥劑：用無菌鑷子夾取浸藥濾紙片，注意把藥液瀝干，分別平鋪于同一含菌平

板上，注意藥劑之間勿互相沾染并在平皿背面做好標記。

⑹培養：將平皿置于28℃下培養48～72h后觀察結果。

實驗材料

1、 活材料：培養3d的黑曲霉（Aspergillus niger）、根瘤菌（Rhizobium sp.）、培養24h的大腸桿菌（E. coli）、巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、培養5d的吸水鏈霉菌“5102”（Sterptomyces hygroscopicus “5102”）、培養24～48h的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens）的斜面菌種；其它自選的微生物材料，包括實驗室已有的和自己從環境中分離得到的均可。

2、 培養基：原則上可以參考以下培養基：*培養基、缺C培養基、缺N培養基、缺P培養基、缺K培養基、缺Zn培養基、葡萄糖牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（含瓊脂 10g/L，每管12 mL）、牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養基、牛肉膏蛋白胨培養液、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基；也可以自己選定其它合適的培養基。

3、試劑： 0.2mol/L K2HPO4、0.2mol/L硼酸、0.2mol/L NaOH、0.1mol/L檸檬酸；1g/L HgCl2，200??g/L鏈霉素，200??g/L青霉素，50g/L石炭酸；或者其它合適的試劑。

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